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一、目的：
1．學(xué)習(xí)SDS—PAGE測定蛋白質(zhì)分子量的基本原理。
2．掌握垂直板型電泳的基本操作技術(shù)。
二、原理：
由實(shí)驗(yàn)十五中已知，蛋白質(zhì)在聚丙烯酰胺凝膠中電泳時(shí)，它的遷移率取決于它所帶凈電荷以及分子的大小和形狀等因素。
1967年，Shapiro等人發(fā)現(xiàn)，如果在聚丙烯酰胺凝膠系統(tǒng)中加入陰離子去污劑十二烷基磺酸鈉（sodium dodecyl sulfate，簡稱SDS），則蛋白質(zhì)分子的電泳遷移率主要取決于它的分子量，而與所帶電荷和形狀無關(guān)。在一定條件下，蛋白質(zhì)的分子量與電泳遷移率間的關(guān)系，可用下式表示：
因此，測定某個(gè)蛋白質(zhì)的分子量，只需比較它和一系列已知分子量的蛋白質(zhì)在SDS-凝膠電泳時(shí)的遷移率就可以了。后來，Weber等人基本按Shapiro的方法對約40種蛋白質(zhì)進(jìn)行了研究，進(jìn)一步證實(shí)了這個(gè)方法地可行性(見圖16-1)。用這種方法測定蛋白質(zhì)的分子量，簡便、快速，只需要廉價(jià)的設(shè)備和微克量的蛋白質(zhì)樣品；所得結(jié)果，在分子量為15,000—200，000的范圍內(nèi)，與用其他方法測得的分子量相比，誤差一般在±10%以內(nèi)。因此，近幾年來，SDS-凝膠電泳測定分子量的方法，已得到非常廣泛的應(yīng)用和迅速的發(fā)展。
為了闡明SDS-凝膠電泳法測定蛋白質(zhì)分子量的原理，許多人進(jìn)行了深入的研究。實(shí)驗(yàn)證明，在蛋白質(zhì)溶液中加入SDS和巰基乙醇后，巰基乙醇能使蛋白質(zhì)分子中的二硫鍵還原；SDS能使蛋白質(zhì)的氫鍵、疏水鍵打開，并結(jié)合到蛋白質(zhì)分子上，形成蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物。在一定條件下，SDS與大多數(shù)蛋白質(zhì)的結(jié)合比為1.4克SDS/1克蛋白質(zhì)。由于十二烷基磺酸根帶負(fù)電，使各種蛋白質(zhì)的SDS-復(fù)合物都帶上相同密度的負(fù)電荷，它的量大大超過了蛋白質(zhì)分子原有的電荷量，因而掩蓋了不同種類蛋白質(zhì)間原有的電荷差別。
SDS與蛋白質(zhì)結(jié)合后，還引起了蛋白質(zhì)構(gòu)象的改變。蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物的流體力學(xué)和光學(xué)性質(zhì)表明，它們在水溶液中的形狀，近似于雪匣煙形的長橢圓棒，不同蛋白質(zhì)的SDS復(fù)合物的短軸長度都一樣，約為18A，而長軸則隨蛋白質(zhì)的分子量成正比地變化。
這樣的蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物，在凝膠電泳中的遷移率，不再受蛋白質(zhì)原有電荷和形狀的影響，而只是橢圓棒的長度也就是蛋白質(zhì)分子量的函數(shù)。
將蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物在不同濃度的SDS-凝膠中電泳，得到的結(jié)果按Ferguson公式作圖，也證明了蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物的上述性質(zhì)。
Ferguson公式：1gmR=1gm0—KRC
該公式原來是Ferguson提出來描述蛋白質(zhì)在淀粉凝膠中電泳行為的，后來證明它也同樣適用于聚丙烯酰胺凝膠電泳，式中mR是蛋白質(zhì)在一定濃度凝膠（C）中的遷移率；m0是當(dāng)凝膠濃度外推到零時(shí)的遷移率即自由遷移率，它與蛋白質(zhì)的凈電荷量（q）成正比，與蛋白質(zhì)在溶液中的摩擦系數(shù)（f）成反比（m0∝q/f，f由溶液的粘滯性、蛋白質(zhì)分子的大小和形狀決定）；KR是阻滯系數(shù)（retardation coefficient），它與蛋白質(zhì)分子量成線性關(guān)系。因此，不同的蛋白質(zhì)分子有不同的mR，m0和KR值，幾種蛋白質(zhì)的Ferguson圖見圖16-2。
而蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物的Ferguson圖則不同（見圖16-3）。
從圖16-3可以清楚地看到，不同蛋白質(zhì)的SDS復(fù)合物的m0值都很接近，分子量相差5倍的蛋白質(zhì)之間，m0值只相差10%，如果忽略這個(gè)差別，就可以認(rèn)為，各種蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物的m0基本上是一個(gè)定值。這表明，不同蛋白質(zhì)的SDS復(fù)合物都帶有相同密度的負(fù)電荷，并具有同樣的構(gòu)象，因此，它們的凈電荷量與磨擦系數(shù)之比（q/f）都接近于一個(gè)定值而不受各種蛋白質(zhì)原來的電荷、分子大小和形狀的影響，因而，在溶液中，自由遷移率就表現(xiàn)出一致性；但在一定濃度的凝膠中，由于引入了凝膠的分子篩效應(yīng)，電泳遷移率mR就成為蛋白質(zhì)分子量的函數(shù)。
根據(jù)以上事實(shí)，可以認(rèn)為SDS-凝膠電泳測定蛋白質(zhì)分子量方法的基礎(chǔ)是可靠的。當(dāng)然，還有許多問題有待于更深入地研究。
在用SDS-凝膠電泳法測定蛋白質(zhì)分子量時(shí)，應(yīng)注意以下幾個(gè)問題：
1．如果蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物不能達(dá)到1.4克SDS/1克蛋白質(zhì)的比率并具有相同的構(gòu)象，就不能得到準(zhǔn)確的結(jié)果。影響蛋白質(zhì)和SDS結(jié)合的因素主要有以下3個(gè)：（1）二硫鍵是否完全被還原：只有在蛋白質(zhì)分子內(nèi)的二硫鍵被徹底還原的情況下，SDS才能定量地結(jié)合到蛋白質(zhì)分子上去，并使之具有相同的構(gòu)象。一般以巰基乙醇作還原劑。在有些情況下，還需進(jìn)一步將形成的巰基烷基化，以免在電泳過程中重新氧化而形成蛋白質(zhì)聚合體。（2）溶液中SDS的濃度：溶液中的SDS的總量，至少要比蛋白質(zhì)的量高3倍，一般需高達(dá)10倍以上。（3）溶液的離子強(qiáng)度：溶液的離子強(qiáng)度應(yīng)較低，最高不能超過0.26，因?yàn)镾DS在水溶液中是以單體和分子團(tuán)的混合體而存在的，SDS結(jié)合到蛋白質(zhì)分子上的量，僅決定于平衡時(shí)SDS單體的濃度而不是總濃度，在低離子強(qiáng)度的溶液中，SDS單體具有較高的平衡濃度。
2．不同的凝膠濃度適用地不同的分子量范圍，Weber的實(shí)驗(yàn)指出，在5%的凝膠中，分子量25,000—200,000的蛋白質(zhì)，其分子量的對數(shù)與遷移率呈直線關(guān)系；在10%的凝膠中，10.000—70,000分子量的蛋白質(zhì)呈直線關(guān)系；在15%的凝膠中，10,000—50,000分子量的蛋白質(zhì)呈直線關(guān)系；3.33%（以上各種濃度的凝膠，其交聯(lián)度都是2.6%）的凝膠可用于分子量更高的蛋白質(zhì)。
可根據(jù)所測分子量范圍選擇最適凝膠濃度，并盡量選擇分子量范圍和性質(zhì)與待測樣品相近的蛋白質(zhì)作標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)。標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的相對遷移率（蛋白質(zhì)的電泳遷移距離除以染料遷移距離即為相對遷移率，詳見后）最好在0.2—0.8之間均勻分布。
在凝膠電泳中，影響遷移率的因素較多，而在制膠和電泳過程中，很難每次都將各項(xiàng)條件控制得完全一致，因此，用SDS-凝膠電泳法測定分子量，每次測定樣品必須同時(shí)做標(biāo)準(zhǔn)曲線，而不得利用另一次電泳的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
3．有許多蛋白質(zhì)，是由亞基（如血紅蛋白）或兩條以上肽鏈（如α-胰凝乳蛋白酶）組成的，它們在SDS和巰基乙醇的作用下，解離成亞基或單條肽鏈。因此，對于這一類蛋白質(zhì)，SDS-凝膠電泳測定的只是它們的亞基或單條肽鏈的分子量，而不是完整分子的分子量。為了得到更全面的資料，還必須用其它方法測定其分子量及分子中肽鏈的數(shù)目等，與SDS-凝膠電泳的結(jié)果互相參照。
4．不是所有的蛋白質(zhì)都能用SDS-凝膠電泳法測定其分子量，已發(fā)現(xiàn)有些蛋白質(zhì)用這種方法測出的分子量是不可靠的。這些蛋白質(zhì)有：電荷異?；驑?gòu)象異常的蛋白質(zhì)，帶有較大輔基的蛋白質(zhì)（如某些糖蛋白）以及一些結(jié)構(gòu)蛋白如膠原蛋白等。例如組蛋白F1，它本身帶有大量正電荷，因此，盡管結(jié)合了正常比例的SDS，仍不能完全掩蓋其原有正電荷的影響，它的分子量是21,000，但SDS-凝膠電泳測定的結(jié)果卻是35,000。因此，在分析SDS-凝膠電泳所得的結(jié)果時(shí)，應(yīng)該小心。一般至少用兩種方法來測定未知樣品的分子量，互相驗(yàn)證。為了判斷待測樣品是否可用SDS-凝膠電泳法來測定分子量，也可以使蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物在不同濃度（交聯(lián)度相同）的SDS-凝膠中電泳，得到Ferguson圖。如果待測樣品的自由遷移率m0與標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的m0基本交于一點(diǎn)（如圖16-3），而且在不同濃度的SDS-凝膠中測得的分子量都相同，則表明此蛋白質(zhì)在SDS-凝膠電泳中的行為是正常的，可以用SDS-凝膠電泳法測定其分子量。
SDS-PAGE有連續(xù)體系及不連續(xù)體系兩種，這兩種體系有各自的樣品溶解液及緩沖液，但加樣方式，電泳過程及固定、染色與脫色方法完全相同。
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