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核酸的檢測(cè)目前仍然主要是使用溴化乙錠這類核酸染色劑及紫外光照射。然而，紫外線對(duì)核酸的降解已有很多文獻(xiàn)報(bào)道，因此可以認(rèn)為它本身就是一種核酸破壞劑。此外，紫外線對(duì)使用者來(lái)說(shuō)也具有危險(xiǎn)性。因此總的來(lái)說(shuō)，目前的這類核酸檢測(cè)技術(shù)會(huì)由于DNA分子的破壞，而導(dǎo)致如測(cè)序、克隆等多種下游應(yīng)用的效率大大降低。無(wú)害化的可見(jiàn)光已經(jīng)被用于檢測(cè)核酸，其主要局限性是只能激發(fā)綠色染料。以其開(kāi)發(fā)的全新安全核酸染料MIDORIGreen而聞名的NIPPON Genetics EUROPE公司，針對(duì)目前的核酸檢測(cè)技術(shù)開(kāi)發(fā)了一種全新的核酸染料檢測(cè)方法，它能夠激發(fā)所有商用核酸染料。
紫外燈的危害性
DNA能夠吸收紫外光譜中的光。其結(jié)果是形成嘧啶二聚體；單鏈DNA和雙鏈DNA斷裂，DNA與DNA發(fā)生鏈間交聯(lián)和DNA與蛋白質(zhì)發(fā)生交聯(lián)。雖然生物體能夠修復(fù)這些DNA損傷并承受上述后果，但瓊脂糖凝膠中的DNA缺乏這些修復(fù)機(jī)制。此外，與整個(gè)生物體相比，凝膠中的DNA量要少得多。下面是對(duì)短期紫外線照射引起的DNA降解的研究結(jié)果：電泳后，凝膠暴露在紫外線下長(zhǎng)達(dá)60秒。PCR產(chǎn)物隨后被分離并克隆到一個(gè)對(duì)照載體中，之前用NdeI和HindIII進(jìn)行雙酶切，然后被克隆并轉(zhuǎn)染到大腸桿菌DH5α(BL21)細(xì)胞中。結(jié)果如下:
暴露在紫外線下的DNA受損嚴(yán)重，克隆效率明顯降低。紫外照射60s后，DNA含量比空對(duì)照組要少得多。因此，我們確認(rèn)了紫外線照射引起的DNA降解并且*破壞DNA。
一代技術(shù)---藍(lán)色LED
2009年，科研界引入了藍(lán)光發(fā)光二極管（LED）透射器。LED是能將電轉(zhuǎn)化為光的半導(dǎo)體。其優(yōu)點(diǎn)是波長(zhǎng)，效率*，平均壽命高達(dá)50000小時(shí)。它們發(fā)射出比紫外線波長(zhǎng)更長(zhǎng)的470nm波長(zhǎng)的光。
重復(fù)上述實(shí)驗(yàn)，并將DNA暴露在藍(lán)色LED燈下相同時(shí)間：
正如理論所預(yù)期的那樣，暴露后每板CFU的數(shù)量沒(méi)有任何顯著變化。因此，防止DNA損傷大大提高了克隆效率。
藍(lán)色LED的問(wèn)題
雖然使用了更為安全的光源，但使用藍(lán)色LED也有一個(gè)主要缺點(diǎn)。溴化乙錠，常見(jiàn)的DNA染色法，在藍(lán)光激發(fā)下其結(jié)果往往比紫外要差很多。溴化乙錠與DNA結(jié)合的激發(fā)峰在480～525nm之間。如結(jié)果所示，溴化乙錠與DNA結(jié)合的信號(hào)非常微弱，幾乎無(wú)法使用。綠色DNA染料，如MIDORIGreen染料，通過(guò)藍(lán)色LED可以提供更好的信號(hào)。
凝膠成像儀
http://www.best-sciences.cn/SonList-2087252.html